فهرست مطالب
عنوان صفحه
چکیده فارسی 1
مقدمه 2
فصل اول: زمینه های نظری موضوع تحقیق
1-1- بخش اول: کلیاتی در خصوص فئوهایفومایکوزیس و عوامل آن 5
1-1-1- مقدمه 5
1-1-1-1- مشخصات ریز بینی 6
1-1-1-2- ویژگیهای فیزیولوژیک 6
1-1-1-3- ویژگی های مولکولی 7
1-1-1-4- پاتوژنژ 7
1-1-1-5- فاکتورهای ویرولانس 7
1-1-1-6- سندرم های بالینی 8
1-1-1-7- کروموبلاستومایکوزیس Chromoblastomycosis 8
1-1-1-8- فئوهایفومایکوزیس Phaeohyphomycosis 8
1-1-2- تاریخچه 8
1-1-2-1- فئوهایفومایکوزیس رینوسربرال در ایران 8
1-1-3- کلادفیالوفورا بانتیانا C. bantiana 10
1-1-4- فئوهایفومایکوزیس 11
1-1-4-1- میزان پراکندگی جغرافیایی بیماری فئوهایفومایکوزیس 11
1-1-4-2- عوامل بیماری فئوهایفومایکوزیس 11
1-1-4-3- اپیدمیولوژی 11
1-1-4-4- تظاهرات بالینی در فئوهایفومایکوزیس 12
1-1-4-5- تشخیص افتراقی فئوهایفومایکوزیس 12
1-1-4-6- فرآورش ( پروسه) ابتدایی نمونه 12
1-1-4-7- اقدامات تشخیصی و تفسیر نتایج 13
1-1-4-8- بررسی میکروسکوپی 13
1-1-4-9- بررسی ماکروسکوپی کشت 13
1-1-4-10- تستهای سرولوژی 14
1-1-4-11- تشخیص مولکولی 14
1-1-4-12- درمان 14
1-1-5- کلادو فیالو فورا ساموفیلا 15
1-2- بخش دوم: بررسی متداول ترین روش های تکثیر اسید نوکلئیک 17
1-2-1- روش های تکثیر اید نوکلئیک بر پایه PCR 17
1-2-2- بررسی روشهای تکثیر هم دما و مقایسه آنها با روش های مبتنی بر PCR 19
1-3- بخش سوم: روش تکثیر دایره ای چرخان RCA: 21
1-3-1- مشخصات روش RCA: 22
1-3-2- آنچه برای انجام واکنشRCA لازم است 23
1-3-2-1- آنزیم Bst پلیمراز 23
1-3-2-2- آنزیم phi29 DNA پلیمراز: 24
1-3-2-3- پروب: 24
1-3-3- واکنش RCA: 26
1-3-3-1- مرحله هیبرید شدن: 26
1-3-3-2- مر حله اتصال(Ligation): 26
1-3-3-3- مراحل تکثیر دایره ای چرخان: 26
1-3-3-4- مرحله تشخیص و بررسی محصول RCA 27
فصل دوم: مروری بر مطالعات گذشته
2-1- پیشینه تحقیق در ضمینه تکنیک RCA 29
فصل سوم: مواد و روش کار
3-1- مواد و لوازم مورد نیاز 32
3-2- دستگاه های مورد نیاز 34
3-3- نوع پژوهش 35
3-4- جامعه پژوهش 35
3-5- روش انجام پژوهش 35
3-5-1 استخراج DNA 35
3-5-2- تعیین بازدهی و کیفیت DNA استخراج شده 37
3-5-3-PCR 37
3-5-3-1- اجزاء واکنش PCR : 39
3-5-3-2- پرایمرهای مورد استفاده جهت PCR : 39
3-5-3-3- طراحی پرایمر PCR 39
3-5-3-4- دمای اتصال پرایمرها به DNA 40
3-5-3-5- dNTP Mix : 40
3-5-3-6-MgCl2 : 40
3-5-3-7- Reaction Buffer: 41
3-5-3-8- Taq DNA Polymerase: 41
3-6- روش انجام PCR : 41
3-6-1- مواد و وسایل لازم : 41
3-6-2- روش کار 41
3-6-3- نکاتی که باید در هنگام انجام PCR باید رعایت کرد : 42
3-6-4- استفاده از کنترل مثبت ومنفی در کیفیت PCR 43
3-6-5- الکتروفورز نمونه های PCR شده بر روی ژل آگارز 43
3-6-6- مواد و وسایل مورد نیاز برای الکترفورز ژل آگارز 44
3-6-7- طرز تهیه بافر TBE 5X (یک لیتر) : 45
3-6-8- روش تهیه ژل آگارز 45
3-6-9- روش نمونه گذاری روی ژل الکتروفورز 46
3-7- انجام واکنش RCA 46
3-7-1- طراحی پروب اختصاصی: 46
3-7-2- تهیه پرایمر: 49
3-7-3- روش اجرای تستRCA: 50
فصل چهارم: نتایج
4-1- آزمون PCR 54
4-2- آزمون RCA 55
4-2-1- بهینه سازی دمای اتصال (Ligation): 55
4-2-2- بهینه سازی دمای RCA 55
4-2-3- بهینه سازی غلضت آنزیم Bst DNA پلیمراز: 55
فصل پنجم: بحث، نتیجه گیری و پیشنهادات
5-1- بحث 58
5-2- نتیجه گیری 62
5-3- پشنهادات 63
منابع 64
چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………69
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول-1-3- پرایمر های مورد استفاده، در تکثیر ناحیه ITS rDNA 39
جدول-2-3- مقادیر لازم برای واکنش25 میکرولیتری PCR ناحیه ITS 42
جدول-3-3- برنامه مراحل مختلف PCR 42
جدول -4-3- مقادیر لازم جهت ساخت TBE 45
جدول -5-3- توالی نوکلئوتیدی ناحیه ITS1 از DNA ریبوزومی 48
جدول -6-3- توالی نوکلئوتیدی پروب طراحی شده برای گونه های قارچی بانتیانا و ساموفیلا 49
جدول-7-3- پرایمر های مورد استفاده در واکنش RCA 49
جدول -8-3- مقادیر لازم برای 10 میکرولیتر واکنش Ligation 50
جدول -9-3- برنامه دمایی مرحله Ligation 51
جدول -10-3- مقادیر لازم برای 20 میکرولیتر واکنش RCA 51
جدول -11-3- برنامه دمایی مرحله Amplification 52
جدول -1-5- مقایسه روشهای ازدیاد DNA در شرایط هم دمایی با PCR 60
فهرست نمودار ها
عنوان صفحه
نمودار -1-1- در نمودار درخت فیلوژنی رده کتوتیریالس که گونه های کلادوفیالوفورا را شامل می گردد 16
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل-1-1- بررسی شکل میکروسکوپی کندی های قارچی کلادو فیالوفورا بانتیانا و کلادوفیالوفورا ساموفیلا 17
شکل -2-1- تصویر شماتیک از پروب طراحی شده برای کلادوفیاالوفورا بانتیانا 25
شکل-3-1- تصویر شماتیک طراحی شده مراحل انجام واکنش RCA 27
شکل-1-3- تصویر سایت NCBI وSearch توالی ژنی قارچ 47
شکل-1-4- نتیجه واکنش PCR برای قارچ کلادوفیالوفورا بانتیانا و کلادوفیالوفورا ساموفیلا 54
شکل-2-4- نتیجه واکنش RCA برای قارچ کلادوفیالوفورا بانتیانا و کلادوفیالوفورا ساموفیلا 55
شکل-3-4- نتیجه واکنش RCA برای گونه های دیگرکلادوفیالوفورا 56
چکیده
پاتوژن های قارچی عوامل عفونی تهدید کننده زندگی برای بیماران بدحال و دارای نقص سیستم ایمنی هستند. روند اپیدمیولوژیک اخیر نشان می دهد تغییرات در گونه های قارچی بخصوص قارچ های سیاه در جهت ایجاد گونه های پاتوژن نوظهور افزایش یافته است. با توجه به کاهش حساسیت بسیاری از این عوامل بیماری زا به داروهای ضد قارچی، شناسایی به موقع در سطح گونه با توجه به سطح و گونه برای مدیریت بالینی ضروری است. با این وجود روش های استاندارد تشخیصی انجام شده وقت گیر، هزینه بر و از حساسیت کمی برخوردار می باشند. برای فائق آمدن به مشکل های ذکر شده، ابزارهایی مبتنی بر PCR1 توسعه یافته اند. در این بررسی به طور اختصاصی از ناحیه رونویسی داخلی ITS 2 اختصاصا مناطق ITS1 و ITS2، از مجموعه ژنی DNA های ریبوزومی قارچ جهت شناسایی به روش Rolling Circle [0]Amplification (RCA )3، به عنوان یک تکنیک مبتنی بر پروب برای تشخیص گونه های قارچی کلادوفیالوفورا بانتیانا عامل بیماری فئوهایفومایکوزیس و کلادوفیالوفورا ساموفیلا استفاده گردید. این پروب در اصل توالی مکمل هدف منتهی به جایگاه لینکر می باشدکه پس از هیبریداسیون با DNAی هدف توسط DNA لیگاز به هم ملحق شده و به شکل یک مولکول بسته در می آید و با اتصال به DNA و تکثیر در شرایط تک دمایی مطالعات مورد ارزیابی قرارگرفت و در نتایج به دست آمده با ملاحظه باند های نردبانی حاصل از الکتروفورز محصول RCA حاکی از انجام واکنش مذکور به طور اختصاصی برای جایگاه تعیین شده بر روی پروب و در کمترین زمان نسبت به روش های دیگر بود.
نتایج نشان دهنده قدرت و دقت این تکنیک در شناسایی عوامل بیماری زای قارچی در حد گونه با سرعت و اختصاصیت بسیار بالا در مقایسه با روش های شناسایی قدیمی می باشد و این تکنیک می تواند کابرد فراوانی در کلیه آزمایشگاه های تشخیصی داشته باشد.
واژه های کلیدی: تکثیر دایره ای چرخان4، کلادوفیالوفورا بانتیانا 5، کلادوفیالوفورا ساموفیلا 6، فئوهایفومایکوزیس7.
مقدمه
امروزه با افزایش کیفیت استانداردهای بهداشتی لزوم به پیشگیری و نهایتا درمان سریع بیماری ها اجتناب ناپذیر می باشد. لذا در این راستا یکی از ابزار های مهم در این مقوله تشخیص به موقع و دقیق می باشدکه یکی از عوامل اصلی کنترل کیفی در کلیه زمینه های بهداشتی و درمانی است. با پیشرفت های انجام شده در علم ژنتیک راه کارهایی در پیش روی محققین قرارگرفته است که توسط آن توانسته اند قدم های بسیار بلندی در امر تسریع کنترل کیفی و تشخیص بیماری ها بردارند. یکی از تحولات عظیم در بحث ژنتیک و به طبع آن تشخیص طبی، اختراع روش واکنش زنجیره ای پلیمراز می باشد.
این تکنیک علاوه بر کمک به اجرای پروژه تعیین توالی موجودات بخصوص انسان در بسیاری از علوم کاربرد پیدا کرده است از جمله ایجاد موجودات تراریخت، کمک به درمان بیماری های مختلف، تولید محصولات صنعتی و دارویی، و از همه مهمتر افزایش دقت و سرعت در بررسی و آزمایش های تشخیصی بوده است.
با این وجود به این تکنیک نیز اشکالاتی وارد بوده که از آن جمله می توان نیاز واکنش زنجیره ای پلیمراز به دستگاه گران قیمت ترمال سایکلر 8و همچنین وقت گیر بودن و نیز احتمال آلودگی و ایجاد واکنش های ناخواسته اشاره کرد که هر کدام محدودیت هایی را در پیش پای متخصصین قرار داده است.
خوشبختانه با ایجاد پایگاه داده های ژنی (Gene Bank) و پروتئینی محققین به روش هایی دست یافته اند که به کمک علم نوپای بیوآنفورماتیک میتوان روش های بسیار دقیق تر، اختصاصی تر و سریع تر از تکنیک های متداول موجود در علوم تشخیصی ارائه نمود(8،9).
در این پروژه سعی شده علاوه بر بررسی تکنیک های جدید مولکولی که به تازگی توسط محققین جهت رفع یکی از نواقص ذکر شده برای واکنش های زنجیره ای پلیمراز به مطالعه آن ها پرداخته اند ، با انتخاب دو واریته از جنس کلادوفیالوفورا که هردو از لحاظ فنوتیپکی بسیار مشابه هم بوده و از نظر فیلوژنی و تاکسونومی به عنوان دو سویه خواهری طبقه بندی شده است به امکان سنجی عملی و بررسی کاربرد تکنیک تکثیر دایره ای چرخان به تشخیص دوگونه قارچی پرداخته شود.
یکی از این گونه ها، کلادوفیالوفورا بانتیانا می باشد که جزء قارچهای سیاه بیماری زا بوده و دیگری کلادوفیالوفورا ساموفیلا می باشد که در دهه اخیر کشف و از طبیعت جداسازی شده و بیماری زایی آن هنوز به اثبات نرسیده است.
در این روش پیش از پرداختن به واکنش باید با استفاده از پایگاه داده

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   تحقیق رایگان دربارهدانش آموز، سلامت روان، دانش آموزان

0 thoughts on “پایان نامه درمورد RCA، بیماری، بررسی

دیدگاهتان را بنویسید