کروموبلاستومایکوزیس اجسام اسکروتیک یا موریفرم به رنگ قهوه ای در بافت حضور دارند نام دیگر این اجسام، اجسام ازگیلی یا مسی می باشد. در فئوهایفومایکوزیس عناصر قارچی در آزمایش مستقیم دیده می شوند اما در موارد تهاجم بافتی باید رنگ آمیزی های هیستوپاتولوژی انجام شود . .(4،5،6)
1-1-4-9- بررسی ماکروسکوپی (کشت)
رو شهای جداسازی و کشت
باتوجه به وفور این قارچ ها در طبیعت، آن ها می توانند به راحتی باعث آلودگی محیط های کشت شوند و برای بازپروری قارچ سیاه از نمونه های بالینی نیاز به محیط های کشت اختصاصی است . رفرانس های مختلف محیط های متفاوتی را جهت جداسازی اولیه این قارچ ها پیشنهاد داده اند. محیط غیر انتخابی سابورو دکستروز آگار می باشد. محیط های انتخابی عبارتند از : محیط های حاوی سیکلوهگزامید، حاوی آنتی باکتریال یا محیط های ژلوز عصاره مغز و قلب BHI)) و ژلوزمهار کننده کپک IMA)) جهت قارچ های مشکل پسند . پس از رشد کافی این قارچ ها، رنگ کلنی ها ابتدا کرم تا نارنجی کمرنگ یا قهوه ای روشن است که باعث می شود شناسایی آن ها به عنوان جنس های فائوئید مشکل باشد .اگر کلنی ها به محیط های گیاهی منتقل شوند بیشتر آن ها به رنگ های زیتونی ، قهوه ای تیره تا سیاه پدیدار می شوند. یکی از این ها محیط سیب زمینی دکستروز آگار PDA)) است(4).
1-1-4-10- تستهای سرولوژی
در حال حاضر هیچ تست سرولوژی جهت تشخیص عفونت های قارچی سیاه از خون یا بافت ها وجود ندارد . گاهی اوقات تست های آنتی ژنی 1 و 3 بتاگلوکان (جهت کاندیدا (و گالاکتومانان (جهت آسپرژیلوس) ممکن است که واکنش متقاطع با قارچ های سیاه داشته باشند اما در بیماران با ضعف سیستم ایمنی که دارای عفونت با قارچ های سیاه و کشت مثبت از این قارچ ها هستند آزمایش سرمی گالاکتومانان مثبت، نشان دهنده عفونت همزمان با آسپرژیلوس می باشد(4).
1-1-4-11-تشخیص مولکولی
برای تشخیص سریع تر عفونت های قارچی تهاجمی با حساسیت و اختصاصیت بالا اخیراً روش های غیرکشت انجام می شود که به روش های مولکولی موسومند. یکی از این روش ها PCR یا واکنش زنجیره ای پلی مراز است. یک روش پان فونگال PCR توسط لاوو وهمکاران شرح داده شد . آن ها ناحیه ITS1 را هدف قرار دادند و توانستند چندین گونه از این قارچ ها را از نمونه های بافتی تازه یا درون فرمالین یا درون پارافین مثل سدوسپوریوم پرولیفیکنس، گونه های اگزوفیالا، اگزروهیلوم روستراتوم و میکروسفاروپسیس آروندینیس پیدا کنند. روش های مولکولی بسیاری جهت تشخیص این قارچ ها صورت گرفته است . روش Real time PCR با استفاده از ناحیه 28s ژن rRNA جهت شناسایی اورئوبازیدیوم پولولانس ،روش AFLP جهت شناسایی استرین های کلادوفیالوفورا بانتیانا، شناسایی رینوکلادیلا ماکنزی با استفاده از ناحیه ITS1 rDNA،شناسایی کلادوفیالوفورا ساتورنیکا به عنوان یک گونه جدید از کتوتریال ها با استفاده از روش مولکولی PCR در ناحیه ژنی ITS وssu و … روش های مولکولی در حال حاضر جهت شناسایی، تاکسونومی و جایگاه فیلوژنی قارچ های سیاه به طور گسترده ای در حال انجام است(4،5،6).
1-1-4-12- درمان
در چند سال اخیر تست های حساسیت دارویی ضد قارچی vitro in به طور قابل ملاحظه ای پیشرفت کرده است. تا سال 1997 روش استانداردی جهت این آزمایشات برای مخمرها و تا سال 2002 جهت قارچ های رشته ای در دسترس نبود در سال 2008 این روش های استاندارد به روز شده است. روش های انجام تست حساسیت دارویی متنوع است که عبارتند: دیسک دیفیوژن، نوار E تست و روش میکرودایلوشن تست MIC)). روش MIC بهترین روش است، MIC ?1 ?g/ml یک شناسه از پتانسیل حساسیت به بیشتر داروها برای درمان عفونت با قارچ های سیاه به جز فلوسیتوزین مورد استفاه قرار گرفته است. هرچه MIC کمتر باشد فعالیت دارو بهتر است.
استفاده از چند داروی ضد قارچی همزمان بیشتر جهت بیماری های قارچی مراحل سخت و شدید انجام می گیرد با وجود این برای قارچ های سیاه این مورد خیلی گسترده شده است. اما برای قارچ های کلادوفیالوفورا بانتیانا وسدوسپوریوم پرولیفیکنس که به ترتیب بیشترین عوامل بیماری های CNS و منتشره هستند و نیاز به بهبودی کامل دارند مطالعات ترکیب داروهای ضد قارچی invitro و invivo برای آن ها انجام شده است(6،5،4(.
1-1-5- کلادوفیالوفورا ساموفیلا9
کلادوفیالوفورا ساموفیلا گونه جدید از کلادوفیالوفورا است که شباهت بسیار زیادی از نظر فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی با کلادوفیالوفورا بانتیانا دارد، که از خاک آلوده شده با بنزن ، تولوئن،اتیل بنزن و زیلن(BTEX) جدا شده است.و اینطور اثبات شده که می تواند با تولوئن و دیگر آلکیل بنزن های مرتبط با آن به عنوان تنها منبع انرژی و کربن رشد کند. پس از بررسی های ژنوتیپی و فنوتیپی و مقایسه های فیلوژنیکی با قارچ مذکور گونه جدیدی با نام کلادوفیالوفورا ساموفیلا را معرفی کردند (نمودار1-1-) (15).طی مطالعات انجام شده به شباهت این قارچ به کلادوفیالوفورا بانتیانا پی برده شد و مطابق آنچه که در درخت فیلوژنیکی موجود مشخص می باشد. جایگاه آن در کنار قارچ بانتیانا به عنوان یک سویه خواهری مطرح گردیده است (7).
در تصویر موجودکه دقیقا از سوش های سفارش شده برای انجام همین رساله می باشد و در مرکز کلکسیون CBS هلند عکس برداری میکروسکوپی صورت گرفته است نیز با مقایسه چشمی میسلیوم های دو قارچ مذکور می توان شباهت میکروسکوپی آن ها را مشاهده نمود.
نکته قابل توجه این که با وجود شباهت بسیار زیاد این دو گونه قارچی یکی از تفاوتهای عمده آنها امکان بیماری زایی برای یکی یعنی کلادوفیالوفورا بانتیانا می باشد و گونه ساموفیلا به صورت غیر بیماری زا در محیط موجود می باشد (تا به حال عامل بیماری زایی آن به اثبات نرسیده است).از تفاوتهای دیگر بین این دو گونه دمای رشد می باشدکه حداکثر دمای رشد در بانتیانا°C42 می باشد و کلادوفیالوفورا ساموفیلا در دمای بالای °C37 رشد نمی کند. تست پاتوژن در مدل های موشی نشان می دهد که کلادوفیالوفورا ساموفیلا غیر بیماری زا در حالی که کلادوفیالوفورا بانتیانا موش را ظرف دو هفته می کشد، هر دوگونه کلادوفیالوفورا، اگرچه در فواصل فیلوژنیکی کوچکی هستند، نشان دهنده اختلافات بوم شناختی قابل توجهی می باشد و شایان ذکر است علت انتخاب این دو گونه برای بررسی کیفیت تکنیک RCA در این تحقیق نیز همین شرایط ویژه این دو گونه می باشد.
به دلیل شباهت کامل مورفولوژیکی و فنوتیپی این قارچ با کلادوفیالوفورا بانتیانا ، تفکیک این دو عملاً امکان پذیر نمی باشد و در بررسی های فیلوژنیکی با وجود شباهت ژنتیکی بیش از 97 درصدی، تشخیص آن ها با روش های معمول ملکولی مثل واکنش زنجیره ای پلیمراز10 و در نتیجه سیکونسینگ دشوار است. (نمودار 1-1-)(16،17)
نمودار -1-1: بدلیل شباهت بسیار زیاد دو گونه مورد بحث در نمودار درخت فیلوژنی ترسیم شده فوق گونه کلادوفیالوفورا ساموفیلا بعنوان یک واریته خواهری از کلادوفیالوفورا بانتیانا مطرح و در یک جایگاه تقسیم بندی قرار گرفته اند.
شکل1)A: فئوهایفومایستوما B: فئوهایفومایکوزیس مغزی در رادیوگرافی : C منظره ریزبینی کلادوفیالوفورا بانتیانا D:کلنی کلادوفیالوفورا بانتیانا
E: نمایش فتوگراف از کلنی کلادوفیالوفورا بانتیانا
1-2- بخش دوم
بررسی متداول ترین روش های تکثیر اسید نوکلئیک
همانطور که قبلا اشاره شد تشخیص های روتین و استاندارد که در آزمایش های قارچ شناسی مورد استفاده قرار می گیرد بسیار وقت گیر، حساسیت پایین و اختصاصیت ضعیف دارند چنان که ملاحظه می گردد دو گونه از جنس کلادوفیالوفورا از لحاظ فیلوژنیکی بیش از 90 درصد به هم شباهت دارند و عملا تشخیص گونه بیماری زای بانتیانا از گونه غیر بیماری زای ساموفیلا بسیار دشوار است (نمودار 1-1-).
هرچند به پشتوانه تکنیک های تکثیراسید نوکلئیک بسیاری از مشکلات فوق الذکر منتفی گردیده است ولی این تکنیک ها نیز هرکدام دارای نواقصی هستند که محققین و متخصصین را در رسیدن به هدف مطلوب با دشواری هایی مواجه می نماید(17،16).
1-2-1- روش های تکثیر اسید نوکلئیک بر پایه PCR
تکثیر اسید نوکلئیک یکی از با ارزش ترین ابزارها در همه زمینه های علم می باشد که کاربرد های درخشانی در زمینه های تشخیص پزشکی، پزشکی قانونی، تعیین هویت دارد. یکی از شناخته شده ترین و معروف ترین روش های تکثیر اسید نوکلئیک، واکنش زنجیره ای پلیمراز(Polymerase chain reaction) است که نوعی روش تکثیر الگوی هدف می باشد. واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی بسیار قدرتمند می باشد که تکثیر توالی منتخبی از توالی مولکولی DNA از یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در مدت کمی امکان پذیر می سازد. این روش در بسیاری از بررسی های علمی نظیر بیولوژی مولکولی، بیماری شناسی و دیگر موارد علمی قابل استفاده است.
انجام PCR متداول نیازمند سه مورد مهم است: 1) دستگاه چرخه حرارتی که جهت انجام مراحل سه گانه در سه دمای مختلف شامل جداسازی11 دو رشته DNA، اتصال12 آغازگرها 13به DNA ی تک رشته ای هدف و نهایتا اعمال دمای تکثیر 14برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز ضروری است.2) انتخاب آغازگر های مناسب برای ژن هدف.3) تشخیص و تایید محصول نهایی پس از انجام مراحل تکثیر توسط الکتروفورز در ژل و آشکار سازی نوارهای قطعات محصول PCR می باشد(11).
هر سه این موارد، محدودیت هایی را جهت بکارگیری این روش در آزمایش های صحرایی و در تست هایی که نیاز به دقت زیادی دارد ایجاد می کند. البته تکنیک PCR علاوه بر محدودیت های فوق معایب دیگری مانند اختصاصیت ناکافی و کارایی تکثیر پایین به دلیل نیاز به چرخه حرارتی را دارد(11).
در روش b DNA15 اساس تکثیر تقویت سیگنال های است که با اتصال آنزیم های آلکالین فسفاتاز 16به رشته DNA به صورت دندریمری17 تکثیر می یابند و چندین ساختار درختی شکل در هر مولکول ایجاد می شود.
اگر چه فقط RT- PCR 18توانسته مصوبه FDA19 را برای آزمایشات تشخیص کمی HIV-1 RNA داشته باشد اما bDNA به تازگی در آزمایشگاه های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می گیرد. مطالعات نشان داده است که تست حساسیت و میزان عملکرد دینامیکی تست bDNA برای بررسی ویروس هپاتیت C نتایج مطلوبی داشته است (26،25،21).
تکنیک واکنش زنجیره ای لیگاز (LCR20) نیز یکی از روش های ابداع شده توسط محققین می باشد که در این روش دو تا الیگونوکلئوتید پیوسته توسط DNA لیگاز 21 که سوار بر DNAی هدف می باشد به هم متصل شده و به صورت یک پروب توسط دستگاه توالی دمایی تکثیر میابد. طی سال های گذشته مطالعات زیادی از طریق مصوبه FDA روی روش های LCR برای تست های تشخیصی مانند عفونت ناشی کلامیدیا تراکوماتیس 22 انجام شده و نشان داده است که این تکنیک حساس تر از PCR می باشد (26،25،21).
دانشمندان تلاش بسیاری را جهت حذف محدودیت های ذکر شده برای PCR نموده اند که از جمله این تلاش ها ابداع روش Real Time PCR است که سبب حذف مورد سوم گردیده و با استفاده از آغازگرهای نشاندار با مواد فلورسنت و بهره گیری از دستگاه فلوریمتر 23هم زمان با انجام فرآیند تکثیر ژن در دستگاه چرخه حرارتی، تشخیص و حضور محصول بطور همزمان صورت می گیرد. این در صورتی است که با در اختیار داشتن مقادیر استاندارد از نمونه مورد آزمایش می توان مقدار بیان ژن را در نمونه تخمین زد (21).
1-2-2- بررسی روشهای تکثیر هم دما و مقایسه آنها با روش های مبتنی بر PCR
همچنان که ملاحظه گردید در استفاده از دستگاه Real Time PCR با اضافه شدن فلوریمتر یک محدودیت حذف گردید و چرخه های حرارتی سریع تر شد ولی کار دستگاه چرخه حرارتی همچنان به

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   تحقیق رایگان دربارههویت، میانگین، معیار

0 thoughts on “پایان نامه درمورد کلادوفیالوفورا، تکثیر، بانتیانا

دیدگاهتان را بنویسید