باشند و همچنین نمونه های از گونه های دیگر کلادوفیالوفورا به صورت زیر مراحل کار انجام گردید.
3-5- روش انجام پژوهش
بعد از هماهنگی‌های لازم با مرکز مطالعات و کلکسیون CBS هلند واقع در آمستردام نمونه ها در شرایط لیوفیلیزه به آزمایشگاه پست گردید.
نمونه های استاندارد پس از تحویل طبق بروشور موجود در بسته بندی در شرایط آسپتیک در محیط پتیتودکستروز براث کشت داده شد و پس از ریکاوری نمونه ها در محیط کشت سابورو دکستروز آگار تیمار گردید پس از کشت و اطمینان از قارچ های ارسالی مراحل زیر جهت انجام پروژه انجام شد.
* استخراج DNA توسط کیت BioRon در طی مراحل ذکر شده در بروشور بسته انجام گردید.
* انتخاب توالی مناسب برای تهیه پروب از طریق سایت NCBI و بررسی آن توسط نرم افزار ClustalX2.
* طراحی پروب67 و پرایمر68
* ایجاد پروب قفلی69
* بررسی سویه ها توسط تکنیک PCR
* بررسی تکنیک RCA و اپتیمایز کردن آن
3-5-1- استخراج DNA
در این روش از کیت استخراج شرکت BIORON(r) آلمان مطابق دستورالعمل کیت استفاده گردید که در آن از تکنیک Spin Column برای جداسازی DNA استفاده شده است که به قرار زیر است :
1. مرحله لیز
مقدار ?l250 از سوسپانسیون قارچی را در یک میکروتیوب 5/1 میلی لیتری ریخته و اگر حجم نمونه کمتری در دسترس بود آن را توسط بافر PBS و یا Tris-HCl 10 میلی مولار با 8 =pH به مقدار مورد نظر می رسانیم. سپس ?l 25 محلول پروتئینازk و?l250 بافر لیزکننده(BL) اضافه می گردد. به آرامی 10 ثانیه ورتکس انجام می شود. بعد در بن ماری 70 درجه به مدت 10 دقیقه انکوبه می گردد. در حین انکوباسیون ورتکس انجام می شود.
2. مرحله اتصال DNA به ستون
مقدار ?l260 ایزوپروپانول به مخلوط نمونه لیز شده اضافه و با پیپت به آرامی مخلوط می گردد. ستون های آبی جداساز DNA را بر روی یک لوله ml2 جمع آوری کننده ضایعات سوار می شوند. کل محلول را بر روی ستون ها انتقال می دهیم. سپس در دور g 8000 برای مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می شود. ضایعات را به همراه لوله دور می ریزیم.
3- مرحله شستشو 1
ستون های آبی را به یک لوله جدید ml2 منتقل می کنیم و ?l500 از بافر pw را بر روی آن می ریزیم. در دور g 8000 برای مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می شود. ضایعات را به همراه لوله دور می ریزیم.
4- مرحله شستشو 2
ستون های آبی را به یک لوله جدید ml2 دیگر منتقل می کنیم و مقدار ?l600 از بافر شستشو دهنده DNA (توسط اتانول مطلق قبلاً به حجم رسیده) را برروی آن می ریزیم و دوباره در دور g 8000 برای مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می شود.
نکته : در این مرحله فقط ضایعات (مایعات خارج شده) دور ریخته می شود و لوله ml2 برای استفاده در مرحله بعدی نگه داشته می شود.
5- مرحله شستشو 3
مرحله قبل توسط همان لوله های ml2 تکرار می شود.
6- مرحله خشک کردن
در این مرحله فقط سانتریفیوژ در دور g 10000 برای مدت 2 دقیقه تا خشک شدن کامل ستون انجام می شود.
7-اضافه کردن بافر شستشو
ستون را بر روی یک میکروتیوب 5/1 گذاشته و ?l200 بافر شستشو دهنده(Elution Buffer ) که از قبل به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه گرما دیده به آن اضافه می کنیم. سپس در دمای اتاق حداقل به مدت 2 دقیقه انکوبه و برای جدا شدن DNA از ستون آنرا در دور g 5000 برای مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می کنیم.
توجه : مایع درون میکروتیوب 5/1 حاوی DNA می باشد.
3-5-2- تعیین بازدهی و کیفیت DNA استخراج شده
برای تعیین غلظت وخلوص DNA ابتدا مقداری(?l10) از DNA استخراج شده را 10 تا 50 برابر رقیق می کنیم و در طول موج nm260(حداکثر جذب DNA) و nm280(حداکثر جذب پروتئین) توسط دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه گیری می کنیم. طبق فرمول زیر غلظت DNA اندازه گیری می شود:
فاکتور رقت ×50 × جذب 260 DNA concentration(?g/ml):
نسبت A260/280 در اسید نوکلئیک خالص 2 می باشد. به طور کلی DNA ژنومیک استخراج شده با این روش نسبت DNA/proteinبین 7/1 تا 9/1 یعنی درجه خلوصی بین 85% تا 95% بدست آمد.
همچنین می توان توسط الکتروفورز در ژل آگارز بازدهی و کیفیت DNA را به طور تقریبی تعیین کرد که در این روش باید DNA استخراج شده را با یک DNA ای که درجه خلوص آن شناخته شده است الکتروفورز کرد و با یکدیگر مقایسه نمود (50،11).
بعد از استخراج DNA ژنومی میکروتیوب های حاوی DNA تا زمان انجام PCR در فریزر 20- نگه داری شدند.
3-5-3- PCR
واکنش زنجیره ای پلیمراز از روشهای تشخیص مولکولی می باشد که روشی ساده ودر عین حال بسیار حساس است که به صورت in vitro جهت تکثیر قطعه بخصوصی از توالی DNA بکار می رود. در این تکنیک از مقدار بسیار اندک توالی DNA مورد نظر در یک واکنش آنزیمی میلیون ها نسخه ایجاد می شود. این روش برای اولین بار توسط کری مولیس70 در سال 1985 ابداع شد که به جهت این کار جایزه نوبل را دریافت نمود. در اصل PCR از مقدار بسیار کم اسید نوکلئیک به عنوان ماده اولیه، مقادیر زیادی DNA را با روشی مشابه(اما خیلی ساده تر) به آنچه در سلولهای زنده دیده می شود، تولید می کند. سنتز DNA در سلول زنده به یکسری آنزیمهای پیچیده به همراه کوفاکتورها که به خوبی شناخته شده نیست، وابسته است که با همکاری این عوامل در مرحله S چرخه سلولی سنتز DNA صورت می گیرد. در PCR اجزاء پایه ماشین تکثیری است که جهت تکثیر قطعات کوتاه DNA در یک لوله آزمایش بکار می رود. PCR با روشی ساده تر، و با استفاده از تعداد کمتر اجزاء ترکیبی و شرایط واکنش با حرارت نسبتاً بالا، سنتز DNA را در آزمایشگاه تسهیل می کند (52،47،46،11).
روند PCR توسط تغییرات دمایی و فازهای مختلف آن با استفاده از دماهای مختلف برای سه مرحله واکنش انجام می گیرد. این سه مرحله عبارتند از:
1- Denaturation
مرحله اول شامل دناتوره یا جدا شدن دو رشته DNA می باشد. دمای این مرحله معمولا بین 92 تا 95 درجه سانتیگراد است. اگرچه برخی محققین ترجیح می دهند که یک دمای دناتوره شدن 98 درجه را در 5 چرخه ابتدایی داشته باشند و بعد از آن با دمای 95 درجه سانتیگراد برای چرخه های بعدی دنبال شود.
2- Annealing
در مرحله دوم که به مرحله اتصال پرایمر با DNA الگو معروف است، دما کاهش پیدا می کند تا پرایمرها توالی مکمل خود را در جایگاه هدف یافته و به آن متصل شوند. این دما بسته به نوع پرایمر متفاوت است.
3- Extension
مرحله گسترش یا طویل سازی زنجیره DNA به منظور طویل شدن انتهای5َ پرایمر اتصال یافته به انتهای 3َ DNA هدف است. این مرحله نیز همانند مراحل ذوب و اتصال از یک عامل دمایی و زمانی تشکیل شده است. در این مرحله دما طوری تنظیم می شود که برای کارکرد بهینه DNA پلیمراز متناسب باشد. در طی این مرحله DNA پلیمراز با افزودن داکسی نوکلئوتید به گروه 3´-OH پرایمرها مولکول دو زنجیره ای جدیدی ایجاد می کند (50،47،11).
جهت تکثیر DNA هدف این چرخه حرارتی سه مرحله ای به دفعات مکرر انجام می شود یعنی بین 25 تا 40 چرخه انجام می شود. البته قبل از شروع چرخه ها می توان برای جداشدن بهتر DNA الگو و فعال شدن DNA پلیمراز یک چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد به عنوان پیش گرما 71در نظر گرفته شود.
در نهایت در سیکل آخر یک چرخه دمایی 72 درجه سانتی گراد برای اطمینان از تکثیر کامل DNA هدف می توان در نظر گرفت. محصولات تکثیری در طول چرخه های اولیه PCR غیر قابل تعیین هستند و فقط بعد از تقریباً 10 تا 20 چرخه از چرخه دمایی قابل تعیین می شود(با استفاده از ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید) (52،11).
3-5-3-1- اجزاء واکنش PCR :
یک مخلوط واکنش PCR معمولی شامل DNA هدف، پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی که بطور اختصاصی طراحی شدند، دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات ها/ یون های منیزیوم/ یک ترکیب بافری /DNA پلیمراز مقاوم به حرارت و آب دیونیزه می باشد (50،47،11).
3-5-3-2- پرایمرهای مورد استفاده جهت PCR
برای هرکدام از ناحیه ITS rDNA از پرایمرهای مربوطه ITS1 و ITS4 بر اساس مقالات ذکر شده سفارش داده شدند پرایمرهای طراحی شده به صورت شیمیایی سنتز شدند و لیوفیلیزه بودند که در آب دیونیزه حل گردید و تیوب اولیه به صورت 100 میکرومول به عنوان ذخیره اصلی 72 در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد و محلول کار پرایمر با غلظت 10 میکرومولار از آن تهیه گردید (جدول 3-1) (14).
جدول 1-3- پرایمر های مورد استفاده در تکثیر ناحیه ITS rDNA
پرایمرITS1
5′-TCCGTAGGTGAA CCT GCG G-3′ Forward
پرایمرITS4
5′-TCCTCCGCTTATTGA TAT GC-3′ Reverse
3-5-3-3- طراحی پرایمر PCR
ترکیب و طول پرایمر از مشخصه های مهم، تکثیر محصولات اختصاصی PCR است. در طراحی پرایمر باید به نکات زیر توجه کرد:
1- پرایمر باید از نظر طول مناسب باشد.(طولی بین 18تا 30 نوکلئوتید)
2- پرایمرها از نظر محتوای GC مناسب باشند.(60%-40%)
3- فاقد توالی های پشت سرهم از پلی پورین 73و پلی پیرمیدین 74باشند.
4- یک پرایمر با پرایمرهای دیگر مکمل نباشد و با خودش هم ساختار سنجاق سری تشکیل ندهد.
5- ترادف پرایمرها طوری طراحی شوند که در دمای Annealing مناسب پرایمر، فعالیت نمایند.
6- استفاده از نرم افزارهای کامپیوتری مثل : Primer3,MEDUSA,Quest primer توصیه می شود (42،39،36،11).
3-5-3-4- دمای اتصال پرایمرها به DNA
جهت محاسبه دمای اتصال پرایمر در PCR روش ها ومعادلات گوناگونی وجود دارد. ایده آل این است که TM هر دو پرایمر Forward و Reverse مانند هم و یا نزدیک به هم باشد. عمومی ترین فرمول مورد استفاده جهت محاسبه Tm پرایمرها عبارت است از:
Tm= [(number of A+T) × 2°C + (number of G+C) ×4°C]
این فرمول در غلظت یک مولار نمک جهت ارزیابی هیبریداسیون الیگونوکلئوتیدها برآورد شده و صادق است. با این حال این فرمول در مورد پرایمرهای بزرگتر از 20 نوکلئوتید دقیق و صحیح نیست.
باید توجه داشت که Tm محاسبه شده صرفاً یک نقطه آغازین جهت بهینه کردن PCR است و Tm واقعی با در نظر گرفتن این نقطه آغاز و به طور تجربی بدست می آید(42،39،36،11).
3-5-3-5- dNTP Mix
داکسی نوکلئوتید تری فسفات ها (dNTP)، قطعات ساختمانی ضروری مولکول های اسید نوکلئیک هستند و همچنین جزء ترکیبات ضروری مخلوط PCR می باشد که بدون آنها DNA جدید نمی تواند تکثیر کند.dNTP ها استفاده شده از شرکت داخلی خریداری شد، که حاوی 100 میکرولیتر از مخلوط هر چهار نوکلئوتید بود(50،47،11).
3-5-3-6- MgCl2
محلول پایه کلرید منیزیم با غلظت 50 میلی مول شرکت سیناژن بدون رقیق نمودن مورد استفاده قرار گرفت. غلظت مورد نیاز برای واکنش PCR، 5/1 میلی مولار بود که به مقدار 5/2 میکرولیتر از محلول اصلی MgCl2 در واکنش PCR با حجم 50 میکرولیتر استفاده شد(50،47،11).
3-5-3-7- Reaction Buffer
بافر واکنش از شرکت سیناژن تهیه گردید وحاوی 500 میلی مول کلرید پتاسیم و200 میلی مول Tris-HCl بود. محلول حاصل که دارای غلظت 10 X بود به همین شکل در 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. غلظت بافر PCR در واکنش 1X بود که مقدار 5 میکرولیتر در واکنش استفاده شد(50،47،11).
3-5-3-8- Taq DNA polymerase
آنزیم پلیمراز Taq از شرکت داخلی که حاوی 1000 واحدآنزیم بود تهیه شد. غلظت آنزیم Unit/ ?l 5 بود که در هر واکنش 2/0 میکرولیتر(1 واحد) از آن استفاده شد. آنزیم Taq از حساس ترین اجزاء واکنش PCR است و باید همیشه تا قبل از استفاده در فریزر 20- نگهداری شود(50،47،11).
3-6- روش انجام PCR
3-6-1- مواد و وسایل لازم
دستگاه ترموسیکلرASTEC] (مدل PC-818، ساخت ژاپن)[
میکروسانتریفوژ (Sigma)
میکروتیوب های 2/0 میلی لیتری
سمپلر و سرسمپلر
دستگاه

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   پایان نامه رایگان دربارهبلوغ دختران

0 thoughts on “پایان نامه درمورد پرایمر، دمای، دقیقه

دیدگاهتان را بنویسید