ورتکس
مواد مورد نیاز برای ساخت Master Mix در PCR
3-6-2- روش کار
ابتدا قبل از شروع ساخت اجزاء Master Mix نمونه DNA هایی که در20- ذخیره شدند را در دمای اتاق گذاشتیم تا ذوب شوند. سپس به تعداد نمونه های DNA طبق جدول 3-2 Master Mix ساخته شد(14،11).
جدول-2-3- مقادیر لازم برای واکنش 25میکرولیتری PCR ناحیه ITS
12.5?L
Ready PCR
Master Mix
0.5 ?L
Primer ITS 1
0.5 ?L
Primer ITS 4
2 ?L
templete DNA
9.5 ?L
D.W
25 ?L
بعد از ساخت Master Mix به هر میکروتیوب 2 میکرولیتر DNA الگو اضافه شد و حجم کل محلول به ?l 25 رسید. سپس به دستگاه ترموسایکلر انتقال داده شد و بعد از انجام 35 سیکل دمایی تکثیر اختصاصی قطعات ژنیITS rDNA مورد نظر صورت گرفت(جدول 3-3).
جدول-3-3- برنامه مراحل مختلف PCR
زمان
دما
تعداد چرخه
مراحل
نام مراحل
2 دقیقه
C°95
1 سیکل
1
Pre Heat
45 ثانیه
°C94
35 سیکل
2
Denaturation
1:30 ثانیه
°C52
3
Annealing
30 ثانیه
°C72
4
Extension
7 دقیقه
°C72
1 سیکل
5
Final Extension
3-6-3- نکاتی که باید در هنگام انجام PCR باید رعایت کرد
1- قبل از انجام کار باید تمامی سطوح با محلول هیپوکلریت 10%(وایتکس) و الکل 70% آلودگی زدایی شوند. این کار منجر به دپورینه شدن و هیدرولیز سریع مولکول های اسید نوکلئیک آلوده کننده می شود.
2- جداسازی قسمت آماده سازی PCR با دستگاه ترموسیکلر و بخصوص الکتروفورز زیرا محصولات تکثیری حاصل از PCR از مهمترین منابع آلودگی به شمار می آیند.
3- استفاده از دستکش های پلاستیکی یا لاتکس یکبار مصرف و پوشیدن روپوش آزمایشگاهی تا آلودگی از طریق پوست و لباس به حداقل برسد.
4- جداسازی سمپلرها، سرسمپلرها، روپوش، تیوب های واکنش از قسمت آماده سازی PCR با قسمت الکتروفورز.
5- تمامی محلولهای استوک و پرایمرها باید در تیوب های کوچکتر تقسیم شوند تا اگر یکی از محلول ها آلوده شد کل استوک آلوده نشود و بتوان به راحتی محلول آلوده را از بین برد.
6- در مواردی که آلودگی شدید است بهتر از پرایمری دیگر برای PCR استفاده شود تا از وجود ویا عدم وجود DNA الگو اطمینان حاصل کرد. اگر آلودگی با محصولات تکثیری بود باید محلول های کار دور انداخته شود و تمام سطوح با اسید هیدروکلریک 1نرمال و یا پسورالن آلودگی زدایی شوند(50،47،11).
3-6-4- استفاده از کنترل مثبت ومنفی در کیفیت PCR
دارا بودن کنترل مثبت و کنترل منفی در PCR به ترتیب به تشخیص حضور یا عدم حضور نتایج PCR منفی کاذب و مثبت کاذب کمک می کند.
1. کنترل مثبت
استفاده از کنترل مثبت تا حد ممکن کمک به جلوگیری از نتایج منفی کاذب می کند. اگر یک کنترل مثبت در PCR یا نمونه بالینی که مشخص شده که دارای مقدار کافی از مولکول های هدف اختصاصی برای مشاهده بعد از الکترفورز می باشد، محصول تکثیرشده تولید نکند، آنگاه نتایج آزمایش به عنوان یک نتیجه PCR منفی در نظر گرفته می شود. عواملی که موجب منفی کاذب می شود شامل: مقدار ناکافی از DNA الگو، عدم حضور یا کیفیت پایین یکی از ترکیبات مخلوط PCR، اشکال در طراحی پرایمر، برنامه نادرست چرخه دمایی در دستگاه PCR (دمای اتصال خیلی بالا و یا تعداد چرخه های ناکافی) (50،47،14،11).
2. کنترل منفی
کنترل منفی به صحت اینکه هر محصول تکثیر شده PCR فاقد آلودگی است کمک می کند. اگر کنترل منفی در PCR محصول تکثیری تولید کند، آنگاه نتایج آزمایش مثبت کاذب در نظر گرفته می شود و حاکی از آلودگی مخلوط PCR است. این آلودگی ممکن است از طریق فضای آزمایشگاه یا از محصولات تکثیر شده قبلی باشد (50،47،14،11).
3-6-5- الکتروفورز نمونه های PCR شده بر روی ژل آگارز
* ژل آگارز
آگار مخلوطی از دو پلی ساکارید آگارز و آمیلوپکتین است که از چند گونه جلبک دریایی به دست می آید. در دمای اتاق جامد است و بصورت تجاری در اشکال پودری یا دانه ای موجود می باشد. عمده ترین تفاوت انواع آگارز در میزان خلوص آن از نظر عدم وجود پلی ساکارید باردار(خاصیت الکترواسمز)، درجه ذوب، قوام و میزان شفافیت است. داشتن خاصیت کمتر الکترواسمز وشفافیت بیشتر از عمده ترین شرایط بهینه آگارز برای استفاده از آن در روش های الکتروفورز می باشد(50،47،14،11).
آگارز که معمولاً به صورت پودر است را می توان با افزودن مقدار معینی از آن به بافر یا آب مقطر و حرارت دادن به صورت محلول در آورد. با کاهش دمای آن به حدود 50-40 درجه سانتیگراد (بسته به نوع آگارز) به حالت ژل درآمده و ساختمان اسفنجی پیدا می کند. اندازه منافذ آگارز وابسته به غلظت آن است. زنجیرهای آگارز رشته های مارپیچی را تشکیل می دهند که ساختار ابرمارپیچی با طول 30-20 نانومتر دارند. سرعت حرکت DNA در ژل آگارز به فاکتورهایی مانند اندازه مولکول DNA، غلظت آگارز، ساختار سه بعدی DNA، نوع آگارز، بافر الکترفورز و وجود اتیدیوم بروماید در ژل و ولتاژ و آمپر اعمالی به ژل و همچنین مدت زمان الکتروفورز بستگی دارد. مولکول های بزرگتر در میان حفره های ژل به دام می افتند و نسبت به مولکول های کوچکتر کندتر حرکت می کنند. هر چه غلظت ژل بیشتر باشد حرکت DNA در ژل کندتر است. حضور اتیدیوم بروماید در ژل و بافر باعث کاهش بار منفی DNA در رشته و افزایش حجم آن می شود ودر نتیجه حرکت کندتر می شود(50،47،14،11).
مرسوم ترین روش برای مشاهده DNA در ژل های آگارز، رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید است. اتیدیوم برماید با داشتن یک گروه حلقوی مسطح در میان DNA قرار می گیرد و در اثر تابش UV نور فلورسنت تولید می کند. در این مطالعه برحسب اندازه DNA مورد نظر برای الکتروفورز از ژل 2% استفاده شد(50،47،14،11).
3-6-6- مواد و وسایل مورد نیاز برای الکترفورز ژل آگارز
* پودر آگارز (Sigma,USA)
* بافر TBE با غلظت 1X

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   تحقیق رایگان دربارهدانش آموز، سلامت روان، دانش آموزان

0 thoughts on “پایان نامه درمورد نور فلورسنت

دیدگاهتان را بنویسید