سانتی گراد، 20 % فعال است و در 80 درجه سانتی گراد، تقریباً غیر فعال است. علت انتخاب دمای 60تا 65 درجه سانتی گراد در واکنش RCA نیز همین مسئله است. Bst پلیمراز قادر است که سنتز را از یک شکاف شروع کند. زیرا از شکاف OH 3َ به عنوان آغازگر استفاده می نماید(44،23،15،14).
1-3-2-2- آنزیم phi29 DNA پلیمراز
آنزیم phi29 DNA پلیمراز در اصل از ژنوم باکتریو فاژ که باسیلوس سوبتیلیس 41راآلوده می کند بدست آمده است. این آنزیم دارای چندین ویژگی قابل توجه است که آن را مناسب و کار آمد برای تکثیر DNA در شرایط محیطی42 نموده است.آنزیم phi29 DNA پلیمراز متشکل از یک پروتئین با جرم مولکولی 68 کیلو دالتون است و عضو B از خانواده پلیمراز ها می باشد(24،22).
دارای دو توانایی در واکنش های مولکولی 5َ به 3َ پلیمرازی و داکسی نوکلئوتیدیلیشن 43 از قسمت پروتئین انتهایی می باشد و همینطور توانایی انجام سه واکنش دگردیشن44 از جمله پیروفسفورولیتیک45 ، اگزونوکلئولیتیک46 3َ به 5َ ssDNA و اگزونوکلئولیتیک 3َ به 5َ ssRNA را دارد(22).
مضاف بر این که آنزیم phi29 DNA پلیمراز توانایی جایجایی رشته 47را دارد و در اصل امکان جابجایی رشته مکمل ساخته شده از روی الگو را دارد(22).
1-3-2-3- پروب
مهمترین بخش در واکنش RCA طراحی پروب48 می باشد و کل واکنش RCA به نحوه عملکرد پروب و دقت در طراحی آن بستگی دارد. در طراحی پروب برای سهولت کار آن را به چند قسمت تقسیم می کنند و هر بخش را جداگانه طراحی و در نهایت به هم متصل می کنند.
از سه قسمت تفکیکی لینکر و آغازگر ها یک سری توالی های ثابت در کلیه پروب های مربوط به انجام واکنش RCA مطابق مقالات ارائه شده می باشد و نیازی به تغییرات ساختاری ندارد و در طراحی می توان برای تمام پروب ها استفاده کرد.
اما مهمترین بخش که حائز اهمیت است انتخاب یک منطقه ژنی مناسب می باشد. این منطقه نباید برای کلیه واریته های قارچی یکسان باشد و این منطقه در موجودات مختلف متفاوت است در اکثر مطالعات انجام شده بر روی قارچ ها ی بیماری زا از منطقه ITS از DNA ریبوزومی استفاده شده است و یا در ویروس Begomovirus از ناحیه PBin 19 برای طراحی پروب استفاده شده است.
پس از انتخاب منطقه برای تعیین توالی نوکلئوتیدی هدف، کلیه سوش های مشابه و گونه های یک جنس را از طریق سایت و بانک اطلاعات ژنی دریافت و توسط نرم افزار های مخصوص ردیف چینی و کوچکترین تغییرات و تفاوت را بررسی و بهترین توالی را برای تهیه پروب از منطقه ژنی مذکور انتخاب می کنیم، بعداز طراحی پروب هنگام سفارش پروب به شرکت سازنده باید بصورتی باشد که انتهای 5َ پروب حتماً فسفریله باشد. علت این موضوع به منظور فعال نمودن آنزیم لیگاز در مراحل اولیه واکنش RCA می باشد(22).
1-3-3- واکنش RCA
RCA دارای چهار مرحله واکنش است: هیبریداسیون، اتصال، تکثیر و ظاهر سازی
پروب طراحی شده دارای چهار قسمت می باشد :
* مکمل انتهای 5َ از توالی هدف
* مکمل انتهای 3َ از توالی هدف.
* جایگاه اتصال دو پرایمر RCA1 و RCA2 بر روی پروب.
* توالی های میانه واقع در بین آغازگر ها و توالی هدف به عنوان اتصال دهنده49.
1-3-3-1- مرحله هیبرید شدن
پروب طراحی شده دارای قسمتی می باشد که دقیقا مکمل با ناحیه ITS1 از DNAی ریبوزومی است. با توجه به اینکه این ناحیه درست از قسمتی که اختلاف نوکلئوتیدی وجود دارد شکسته شده است برای اتصال نیاز به هیبرید شدن 50با توالی هدف دارد در نتیجه ابتدا انتهای 3َ و سپس انتهای 5َ به توالی هدف متصل می گردد (15،14،12).
1-3-3-2- مر حله اتصال(Ligation)
بعد از اتصال پروب به DNA هدف که در دمای62 انجام می گیرد در همین حین آنزیم لیگاز نیز شروع به فعالیت کرده پروب نیمه باز را به صورت حلقه کامل به هم متصل می کند51 .
1-3-3-3- مراحل تکثیر دایره ای چرخان
واکنش تکثیر دایره ای چرخان52 خود شامل دو قسمت است
أ‌- گسترش اول: در این مرحله با اتصال پرایمر RCA1 در جایگاه خود بر روی پدلاک پروب یک کپی کامل به صورت خطی از پروب توسط آنزیم Bst DNAپلیمراز صورت می گیرد در این شرایط یک جایگاه اختصاصی برای پرایمر RCA2 ایجاد می گردد.
ب‌- گسترش دوم: پس از تشکیل جایگاه اتصال RCA2 بر روی اولین محصول Bst DNAپلیمراز ، پرایمر دوم به جایگاه خود متصل شده و در امتداد محصول اولیه توالی دوم توسط آنزیم Bst DNAپلیمراز تکثیر می گردد. بدین ترتیب انتهای محصول اولیه جایگاه پرایمر دوم و ابتدای محصول بعدی خواهد بود. این پروسه بصورت متوالی تکرار می شود تا پایان زمان مورد نظر حدود 109 کپی از هر رشته DNA ایجاد می گردد(23،20،18).
1-3-3-4- مرحله تشخیص و بررسی محصول RCA
این مرحله به دو صورت شناخته شده قابل انجام است. می توان محصول نهایی را از طریق الکتروفورز که اساس تفکیک آن بر پایه بار الکتریکی اسید های نوکلئیک و اندازه رشته DNA می باشد انجام داد. و یا با نشاندار کردن پرایمر می توان بصورت کینتیکی در زمان واقعی مراحل تکثیر را تعقیب و ثبت نمود که البته این تکنیک هزینه بر بوده و نیاز به دستگاه Real Time PCR دارد(22،20،14).
شکل شمار3-1- : تصویر شماتیک طراحی شده برای نشان دادن مراحل انجام واکنش RCA
فصل دوم: مروری بر مطالعات گذشته
2-1- پیشینه تحقیق در ضمینه تکنیک RCA
پل لیزاردی آغازگر تحقیق در زمینه همانند سازی DNA به صورت دوایر متوالی 53بود. و در سال 2002 موفق به اخذ گواهی پتنت برای اختراع خود گردید.
اولین بار ایشان بر روی شناسایی DNA های موتانت یافته و مسبب سرطان مطالعه کرد. از سال 2001 این تکنیک به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است و مزایای ویژه این تکنیک باعث شده تا درعرصه ی تشخیص طبی جایگاه ویژه ای را به خود اختصاص دهد.(26)
در سال 2007 متس نیلسون و همکاران بر روی آنالیز ژن به صورت بسته و حلقه چرخشی فعالیت نموده و ثابت کردند که با طراحی یک پروب اختصاصی برای منطقه خاصی از ژنوم هر موجود و جفت شدن معکوس با ژن هدف آن میتوان به صورت کاملا تخصصی با کارایی و حساسیت بسیار بالایی حتی با یک نوکلئوتید تفاوت (SNP) 54به شناسایی ژن و در نهایت عوامل زیستی پرداخت.(26،24)
ایشان با این روش اولیگو نوکلئوتید هایی را که قابلیت حلقه شدن دارند را با عنوان Padlock Prob جهت ازدیاد DNA بصورت چرخشی برای تشخیص ژن معرفی کرد.
چیا یینگو و همکاران 55در سال 2008 با بررسی ژنوم ویروس بگوموویروس56 توانستند منطقه ای مناسب برای طراحی پروب شناسایی برای واکنش RCA پیدا نمایند.
در این تحقیق از ناحیه PBin 19 برای طراحی پروب استفاده شده است زیرا در مقایسه توالی ژنی آن منطقه در بانک اطلاعات ژنی (GenBank accession no. EF458639) بهترین ناحیه مربوط به پروموتور CaMV 35S انتخاب شده که توالی است کاملا اختصاصی بدون مشابهت با دیگر توالی ها می باشد. این منطقه حاوی ژنهای کد کننده پروتئین های cp و Rep می باشد.(25)
برای انجام مطالعات پلی مورفیسم محل های شناسایی آنزیم محدودالاثر Bam H I و EcoR I و Hin III که بترتیب بطور اختصار با حروف B, E & H در شکل زیر مشخص است پس از اعمال آنزیم رشته های 3X , 2X & 1X بدست می آید.
نکته قابل توجه اینکه منطقه pBinAY1.10 و pBinAY4.2 حاوی ژنوم AYVTV در جهات مختلف میباشد. ولی این امر در ناحیه pBin19-35s صادق نیست.(25)
باید توجه داشت که ممکن است توالی هایی در ناحیه ژنی وجود داشته باشد که هیچ تاثیری در حساسیت آزمایش ندارند که در شکل بصورت نقطه چین نشان داده شده است.
پرایمر های طراحی شده از روی توالی ژنAYVTV-[NT] بدست آمده است و آنزیم مناسبی که برای واکنش Amplification مورد استفاده قرار گرفته است آنزیم ترمو استیبل Ph29 DNA پلیمراز می باشد.
نتایج بدست آمده پس از ظهور محصول RCA و برش آنزیم های برش دهنده اختصاصی57 نشان دهنده تکثیر DNA هدف توسط واکنش های RCA بود (25).
زیائویانگ و همکاران در سال 2008 در مطالعه ای که انجام دادند بیست و هشت ایزوله بالینی را مورد مطالعه قرار دادند که عبارتند از دو واریته از کاندیدا آلبیکانس58، دو واریته کاندیدا گلابراتا59، سه واریته کاندیدا کروزه ای ، سه واریته کاندیدا تروپیکالیس، 60سه واریته کاندیدا دابلینسیس، 61سه واریته کاندیدا گیلیرموندی، 62چهار واریته آسپرژیلوس فومیگاتوس، 63دو واریته آسپرژیلوس فلاووس،64 و سه سویه هر یک از سودوسپوریوم آپیوسپرمیوم 65و سودوسپوریوم پرولیفیکنس 66است. هویت گونه ها با روش های آزمایشگاهی استاندارد مورد تائید قرار گرفت و با تجزیه و تحلیل توالی ITS به اثبات رسید.(14)
نمونه های جدا سازی شده در آب مقطر استریل در دمای 25 درجه سانتی گراد نگهداری شدند و پس از استخراج DNA منطقه ITS که شامل ITS1 ، S 8/5 rRNA و ITS2 می باشد با استفاده از دو آغازگر ITS1 و ITS4 به روش واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر داده شد. این منطقه برای واکنش RCA مطابق با آنچه که قبلا ذکر گردید استفاده شد (14).
نتایج حاصل در مقایسه با روش های استاندارد کشت و مدت زمان سپری شده برای هر دو آزمایش بسیار جالب توجه بود. ایشان محصول واکنش را به دو روش ژل الکتروفورز و Real Tim PCR به صورت کمی و کیفی ارزیابی نمود. و با توجه به دقت، هزینه و سرعت کار این تست را به عنوان برترین تست ممکن برای تشخیص عوامل میکروبی معرفی نمود.
فصل سوم: مواد و روش کار
3-1- مواد و لوازم مورد نیاز:
مواد مورد نیاز
کمپانی سازنده
قارچ سویه کلادوفیالوفورا بانتیانا
CBS
قارچ سویه کلادوفیالوفورا ساموفیلا
CBS
گونه های دیگری از کلادوفیالوفورا
CBS
محیط کشت سابرودکستروز آگار
Merck
پروب
کوثر
پرایمر F&R
کوثر
میکروتیوب 5/1
Auxilab
میکروتیوب 2/0
Auxilab
گاز استریل
صانع طب
سرسمپلر آبی،زرد و کریستالی
Auxilab
دستمال کاغذی
Softlan
دستکش لاتکس
Medisave
دستکش بدون پودر
Medisave
کیت استخراج DNA
BIORON
لوله فالکون 15 و 50
auxilab
رک سر سمپلر
Eppendorf
آگارز
Fermentas
پروب PCR
کوثر
Taq DNA پلی مراز
Biolabs
Bst DNA پلی مراز
Biolabs
مستر میکس
Biolabs
آنزیم DNA لیگاز
Biolabs
بافر DNA لیگاز
Biolabs
رک میکروتیوب
Eppendorf
مارکر 100 bp
Biolabs
لودینگ بافر
Biolabs
اتیدیوم بروماید
Fermentas
TBE 10X
کوثر
ماسک
Medisave
محیط کشت پتیتو دکستروز براث (PDB)
Merck
3-2- دستگاه های مورد نیاز:
نام دستگاه
کمپانی سازنده
مدل
Instrument
دستگاه ترمال سایکلر
Actec
PC818
Thermal cicler
انکوباتور
Memmert
INCO2
incubator
سانتریفیوژ
Sigma
3K30
Centrifuge
میکروفیوژ
Sigma
1-14
Microfuge
هیتر میکسچیر
IKA
RET basic C
Heater mixture
روتاتور
IKA
MS2
Rotator
دستگاه ژل داکیومنتیشن
UViDOC
DOC- CF08 TFT
Gel documentation
اسپکتروفتومتر
WIP
Biowave
spectrophotometer
یخچال
Bosch
refrigrator
فریزر
Bosch
freezer
تانک الکتروفورز
اختریان
Electrophoresis tank
پاور ساپلای
اختریان
Power Supply
ماکروویو
بوتان
Microwave
بن ماری
Memmert
Bath
3-3-
نوع پژوهش
نوع طرح به صورت کاربردی می باشد و پژوهش انجام گرفته به صورت طراحی و بررسی روایی و پایائی ابزارها و تست ها است.
3-4- جامعه پژوهش
دراین مطالعه که دارای دو گروه مورد یعنی قارچ استاندارد کلادوفیالوفورا بانتیانا به شماره 173.52 از CBS هلند و قارچ کلادوفیالوفورا ساموفیلا به شماره 110553 از CBS هلند می

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   پایان نامه رایگان دربارهطلاق، ازدواج مجدد، سن ازدواج

0 thoughts on “پایان نامه درمورد فعال نمودن

دیدگاهتان را بنویسید