قوت خود باقی است.
تحقیقات بسیاری جهت حذف دستگاه چرخه ی حرارتی صورت گرفته است تا اینکه با مطالعه دقیق، فرآیند تکثیر ژن در داخل سلول های موجودات زنده که اولا در یک دما صورت می گیرد و ثانیا در دماهای بسیار پایین تر از 72 درجه سانتی گراد است. ایده ی ابداع روش های تکثیر هم دما در یک دمای پایین و ثابت شکل گرفت و این روش ها به تکثیر هم دمای DNA موسوم گردیدند(15،11).
متخصصین می کوشند تا روش های تکثیر ژنی را همچون سایر روش های متداول تشخیصی برای کاربران آسان و مقرون به صرفه نمایند. روش های بسیار متعددی از تکثیر ژن در شرایط هم دما بدون نیاز به دستگاه چرخه ی حرارتی ابداع شده است ولی از موفق ترین روش های هم دما در تکثیر ژن می توان به روش های ایزوترمال:
* تکثیر وابسته به توالی اسید نوکلئیکی 24(NASBA) ،
* همانندسازی توالی خودنگهدار (SSSR)25،
* تکثیر جایگزینی رشته (SDA)26 ،
* تکثیر هم دما وابسته به حلقه (LAMP) 27،
* تکثیر هم دمای وابسته به هلیکاز (HDA) 28،
* تکثیر واسط رونویسی (TMA) 29،
اشاره کرد که هرکدام با توجه به مزایا و محدودیت هایی که دارند توانسته اند بخشی از نیاز های جامعه ی مخاطب را برآورده سازند و چشم انداز روشنی را برای استفاده از این روش های تکثیری دارای نوآوری هایی در بازآغازی چرخه های جدید برای تکثیر DNA است داشته باشد. برای مثال در PCR از حرارت جهت واسرشت سازی DNA دو رشته ای برای انجام دور بعدی سنتز DNA استفاده می شود. در SSR و NASBA واسرشت سازی به وسیله ی حرارت حذف شده و از یک سری واکنش های رونویسی و رونویسی معکوس جهت تکثیر توالی هدف بهره می برند. به همین نحو در SDA نیز حرارت جهت واسرشت سازی حذف و چرخه های سنتز DNA با به کار گیری آنزیم هضم کننده و سنتز رشته ی DNA جایگزین و نوکلئوتیدهای تغییر یافته به عنوان سوبسترا ادامه می یابد(45،44،38،21،16،15).
روش HDA نیز مبتنی بر استفاده ی توام از آنزیم هلیکاز و DNA پلیمراز به صورت ایزوترمال در دمای اتاق (37 درجه سانتی گراد) و یا 65-60 درجه سانتی گراد می باشد و می تواند برای تکثیر الگو های ژنی DNA و RNA به کار رود. شاید بتوان این روش را آسان ترین روش تکثیر کننده ی ژنی دانست که بتواند در آینده به عنوان جدی ترین رقیب PCR قلمداد شود و امکان بومی سازی آن برای کشور ما نیز وجود دارد. این روش میتواند برای تمامی موارد استفاده ی PCR در بیولوژی مولکولی و مهندسی ژنتیک قرینه داشته باشد و حتی در جدیدترین رویکرد منطبق بر این روش، امکان تکثیر الگوهای پلاسمیدی به صورت In Vitro و فارغ از استفاده ی تکنیک کلونینگ وجود دارد(45،15).
همه ی این روش ها می توانند توالی اسید نوکلئیک را به مقدار مشابهی تکثیر نمایند و آشکار سازی ها به کمتر از 100 کپی در ظرف یک ساعت یا بیشتر منتهی می گردد. اما این روش ها همچنان کاستی هایی دارند. آنها هنوز به ابزاری دقیق برای تکثیر و نیز یک روش پر زحمت برای آشکار سازی محصولات تکثیر یافته نیاز مندند. زیرا اختصاصیت ضعیفی برای توالی هدف دارند، البته روش جدید HDA معایب روش های پیشین را مرتفع نموده است. با وجود سادگی و مقدار زیاد محصول تکثیر یافته در PCR به علت نیاز به دقت بالا در چرخه های دمایی، مانع این گردیده که این روش قدرتمند استفاده ی وسیعی بیابد و بعنوان یک ابزار متداول در آزمایشگاه های خصوصی در آید. با وجود این که در NASBA و SSR از چرخه های دمایی استفاده نمی شود و عمدتا تکثیر در دمای کمتر از 40 درجه سانتی گراد انجام می شود. اما این دو روش اختصاصیت جالبی ندارد زیرا واکنش ها به دلیل هضم DNA نامربوط در نمونه افزایش می یابند و باعث کاهش اختصاصیت می شود. همچنین به علت استفاده از نوکلئوتید های تغییر یافته به عنوان سوبسترا هزینه ها افزایش می یابد. اگر چه استفاده از آغازگر های چند گانه در SDA مشابه آنچه که در PCR چند گانه استفاده می شود مانع از تکثیر غیر اختصاصی توالی هدف می شود، ولی هنوز رسوب توالی های نامربوط تکثیر یافته یک عامل عمومی برای تکثیر اسید های نوکلئیک با این روش محسوب می شود که به ویژه آن را برای استفاده های تشخیصی نامناسب ساخته است(45،44،21،16).
TMA یک روش تکثیر رونویسی RNA می باشد که با استفاده از آنزیم های RNA پلیمراز و رونویسی معکوس در یک واکنش ایزوترمال باعث تکثیر DNA یا RNA هدف می شود. در آزمایش TMA توالی تکثیر یافته توسط تکنیک کمولومینسانس30 قابل بررسی هستند. TMA از طریق مصوبه FDA برای تست های تشخیصی بر روی کلامیدیا تراکوماتیس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 31قابل انجام است. در یک آزمایش انجام شده برای تشخیص HIV-1 RNA اخیراً نشان داده شده است که تکنیک TMA بسیار حساس تر از bDNA و RT- PCR می باشد(21).
1-3- بخش سوم: روش تکثیر دایره ای چرخان (RCA)
در دهه های اخیر بر روی روش های گوناگونی کار شده است تا بتوان اختصاصیت، کارآیی تکنیک و از طرفی هزینه آزمایشات ژنتیک مولکولی را کاهش داد.
نوتومی و همکاران 32در سال 2000 روشی بنام LAMP را ابداع کردند که یک نوع روش سریع تکثیر کردن DNA می باشد و در شرایط ایزوترمال DNA با اختصاصیت، کارآیی و سرعت نسبتاً بالایی در یک دمای ثابت تکثیر می یافت و حساسیت آن نسبت به PCR به میزان 100 برابر بیشتر می باشد. نتیجه کلی با بررسی یون های پیروفسفات که در مقدار زیاد بصورت رسوب سفید رنگی خود را نشان می دهد، قابل ارزیابی است و بررسی حضور یا عدم حضور این رسوب می تواند وجود یا عدم وجود نوکلئیک اسید را در تیوب تایید نماید(44،38،16،15).
پل لیزاردی 33آغاز گر تحقیق در زمینه همانند سازی DNA به صورت دوایر متوالی Rolling circle بود. اولین بار ایشان بر روی شناسایی DNAهای موتانت یافته و مسبب سرطان مطالعه کرد. از سال 2001 این تکنیک به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است و مزایای ویژه این تکنیک باعث شده تا در عرصه ی تشخیص طبی جایگاه ویژه ای را به خود اختصاص دهد(26).
در سال 2007 نیلسون و همکاران 34بر روی آنالیز ژن به صورت بسته و حلقه چرخشی فعالیت کردند و ثابت کردن که با طراحی یک پروب اختصاصی برای منطقه خاصی از ژنوم هر موجود و جفت شدن معکوس با ژن هدف آن میتوان به صورت کاملا اختصاصی با کارایی و حساسیت بسیار بالایی حتی با یک نوکلئوتید تفاوت (SNP)35به شناسایی ژن و در نهایت عوامل زیستی پرداخت.
ایشان با این روش اولیگو نوکلئوتید هایی را که قابلیت حلقه شدن دارند را با عنوان Padlock Prob جهت ازدیاد DNA بصورت چرخشی برای تشخیص ژن معرفی کرد(24).
در سال 2008 زیائو یانگ و همکاران36برای اولین بار پروبهای اختصاصی را جهت تشخیص دقیق و سریع گونه هایی از قارچ های کاندیدا، آسپرژیلوس و سودوسپریوم را بر پایه منطقه ژنی ITS rDNA 37را با استفاده از تکنیک RCA که از حساسیت و دقت بالایی برخوردار می باشد را امکان سنجی کرد. در شکل 1-4 یک نمای شماتیک از نحوی عمل واکنش RCA که توسط زیائو یانگ و همکاران انجام گرفته است نشان داده شده است. با وجود این که طراحی و ساخت پروب های اختصاصی برای این روش بسیار دشوار می باشد ولی با کامل شدن بانک های اطلاعاتی از طریق نرم افزارهای BLAST ،Bionumeric ، BLASTN ، BioManager ،Clustal X & V و پیشرفت های انجام شده در علم بیوانفورماتیک این مشکل نیز در درجهت اجرایی تر شدن تکنیک RCA منتفی گردیده است(31،20،14).
1-3-1- مشخصات روش RCA
* کل واکنش تکثیر تحت شرایط تک دمایی به شکل پیوسته انجام می پذیرد.
* در RCA نیاز به مرحله واسرشت سازی اسید نوکلئیک دو رشته ای به تک رشته ای برای شروع واکنش پلیمریزاسیون نیست و بدون واسرشت سازی به راحتی انجام می پذیرد.
* کارایی تکثیر فوق العاده بالاست، زیرا در این تکنیک هیچ زمانی جهت تغییر دما از دست نمی رود و واکنش در دمای بهینه فعالیت آنزیم به شکل پیوسته انجام می گیرد و 102کپی از DNA هدف در 25 میکرولیتر از مخلوط واکنش در عرض 30تا 60 دقیقه تکثیر میابد.
* با ایجاد یک قالب خواندن آزمایش را آسانتر می کند.
* قطعه تک رشته ای ایجاد شده می تواند در شرایط ایزوترمال با پرایمر واکنش دهد در نتیجه نیاز به دستگاه توالی دما38 منتفی است.
* با توجه به آسان بودن عملیات آزمایش RCA می توان به صورت سیار و در هر محلی این آزمایش را انجام داد و نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی خاص ندارد و با یک بنماری ساده نیز می توان این آزمایش را انجام داد.
* با توجه با اینکه این روش در شرایط دمایی یکسان انجام می گیرد در نتیجه زمان صرف شده برای این آزمایش بسیار کمتر از تست هایی است که نیاز به توالی زمانی متناوب دارند.
* با وجود اینکه تهیه پروب اختصاصی آن مشکل است ولی از یک ترکیب پروب برای مصرف بیش از 5000 بار می توان استفاده کرد.
* با توجه به اینکه در این روش از پرایمر اختصاصی استفاده نشده است و منطقه ای که پروب برای آن طراحی گردیده متنوع می باشد می توان برای جدا سازی و تشخیص واریته های ناشناخته از همان گونه می توان استفاده نمود.
* برای تمام گونه ها و موجودات کاربرد دارد و گونه های وابسته بهم می توانند از طریق RCA بسیار دقیق تر شناسایی و تفکیک شوند.
* این تفکیک جدید با داشتن یک پروب بسته و دو آغازگر بسیار اختصاصی عمل می کند و در عین حال چون تهیه پروب و پرایمر از طریق بانک اطلاعات امکان پذیر است بسیار انعطاف پذیر است.
* نیاز به هیچ دستگاه گران قیمتی ندارد و آزمایش به صرفه ای است.
* نه تنها محصول غیر اختصاصی تولید نمی کند بلکه از تکثیر شدن غیر اختصاصی که عموما در PCR دیده می شود جلوگیری میکند.
* پروپهای ساخته شده می تواند هم برای DNA و هم برای RNA استفاده شود.
* باند شدن جفت بازهای واتسون و کریک بسیار دقیقتر انجام می شود.
* در آزمایش RCA تشخیص را می تواند با تعداد اندک DNA نیز شروع کند.
* محصولات واکنش مخلوطی از DNA های با ساختار شبیه گل کلم با حلقه های متعدد که اتصالاتی با توالیهای معکوس تکراری از توالی هدف را ایجاد می نماید که حتی زیر میکروسکوپ نوری هم به راحتی قابل مشاهده است.
* روش RCA امکان تشخیص انتخابی را با وجود پروب بر احتی فراهم می کند زیرا با وجود پروب و پرایمرها فقط یک ناحیه را مورد شناسایی قرار می دهد.
* عدم نیاز به واسرشت نمودن DNA اولیه و حتی عدم نیاز به استخرج DNA در برخی از نمونه های بیولوژیکی یکی دیگر از چندین مزیت تکنیک RCA می باشد .
* با توجه به اینکه در ابتدای کار فاکتورهای موثر در واکنش، DNA الگو و زمان انجام واکنش بهینه سازی می شوند، نسبت به تلاشهایی که جهت کوتاه نمودن زمان تشخیص و بهینه سازی با دستگاههای متداول PCR صورت می پذیرد قابل توجه است (25،16 و 29-34).
1-3-2- آنچه برای انجام واکنشRCA لازم است
1-3-2-1- آنزیم Bst DNAپلیمراز
در RCA بهترین تکثیر با آنزیم Bst DNAپلیمراز یا BcaBEST پلیمراز به دست می آید. Z-Taq DNA پلیمراز با وجود شرایط واکنش RCA کارایی کمتری دارد.
Bst پلیمراز قطعه ی بزرگ آنزیم DNA پلیمراز باکتری باسیلوس استئاروترموفیلوس 39 است که دارای فعالیت پلیمریزه کنندگی از 5َ به 3دارد، اما فاقد دومینی است که فعالیت اگزونوکلئازی 40َََ 3َ به ََََ5َ را دارا باشد. همچنین فعالیت اگزونوکلئازی 5َ به 3َ را نیز نشان می دهد. وزن مولکولی آن حدود 67000 دالتون می باشد. Bst پلیمراز یک آنزیم حاصل از مهندسی ژنتیک است و از یک سویه ی E. coli استحصال شده است. دامنه ی فعالیت دمایی آن به این صورت است که در 37 درجه سانتی گراد، 10 تا 15 % فعال است، در 50 درجه سانتی گراد، 30 تا 45 % فعالیت دارد. در 60 تا 65 درجه سانتی گراد، دارای 100 % فعالیت است، در 70 درجه

این مطلب مشابه را هم بخوانید :   پایان نامه رایگان دربارهقصاص، زنان مسلمان، نفقه

0 thoughts on “پایان نامه درمورد تکثیر، RCA، سازی

دیدگاهتان را بنویسید